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鉴于二氧化碳培养箱在使用过程中会伴随着微生物滋生，为确保培养箱免受污染，细胞能拥有安全的生长环境，出现了各种灭菌方法：如紫外灭菌消毒、贬贰笔础过滤除菌、液体消毒剂及加热灭菌等。
01紫外灭菌消毒
难以清除二氧化碳培养箱风道等避光处污染，且紫外灯光线会随时间而衰减，灭菌效果较差。
02贬贰笔础过滤器除菌
内部增加贬贰笔础滤膜，箱内不锈钢内胆光滑表面等都具有污染物防护作用。
03二氧化碳培养箱液体消毒剂
简易的消毒方法，有一定的效果但不能保证灭菌。
相较而言，加热灭菌方式是比较有效的方法，分为湿热灭菌和干热灭菌两种，目前市面上最常见的是90度湿热灭菌和140度干热灭菌两种。
01二氧化碳培养箱湿热灭菌
湿热灭菌指温度超过100℃后水转变为水蒸汽并产生高压强，对微生物进行高压及穿透性导热灭菌，而培养箱使用90℃湿热灭菌通常无法达到理想的灭菌效果。
02二氧化碳培养箱干热灭菌
干热灭菌是通过高温使蛋白质及核酸变性失活，达到杀灭的目的，但干热140度仍会存在灭菌不的情况，部分芽孢和孢子可能无法灭活。